紫外-可见分光光度法(卷名：化学)
ultraviolet-visible absorption spectroscopy
根据被测量物质分子对紫外－可见波段范围(150～800纳米)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而改变的函数关系的曲线（即将吸光度对波长作图而得到的曲线），叫吸收光谱或吸收曲线（图1）。
紫外－可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成，最大吸收波长(vλmax)表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构(或成键、非键和反键电子) 有关。一般地说，结合比较牢固的电子，如σ 电子需要吸收较高能量的辐射(短波)才能激发；结合松弛的电子，如π 电子则用波长较长的辐射即可激发。例如，甲烷分子只含σ 键，产生σ →σ*跃迁， 相应的最大吸收出现在125纳米处。而不饱和烃乙烯双键上的π电子产生π→π*跃迁，其最大吸收出现在165纳米处。辐射吸收定律 物质对辐射的吸收遵循布给-朗伯-比尔定律。1729年法国P.布给首先发表，1768年德意志J.H.朗伯重新提出辐射的吸收与吸收层厚度的关系。他们提出：当单色辐射通过物质时，随着吸收介质厚度的增加，透过的辐射强度以指数形式减少。这个定律通常称为布给定律或朗伯定律。1852年德意志A.比尔又发表了辐射的吸收和吸收物质浓度的关系：当单色辐射通过一定厚度吸收层的物质时，吸光度与物质的浓度成正比，称为比尔定律。将以上两个定律合并，称为布给-朗伯-比尔定律或朗伯-比尔定律，用下式表示：
A＝lg(I0/I)＝εbc式中A表示吸光度；I0表示进入吸收层的入射辐射强度；I表示透过吸收层的辐射强度；b表示吸收层的厚度;c表示吸收物质的浓度；ε表示摩尔吸光系数。ε的物理意义是物质浓度为1摩尔／升和吸收层厚度为1厘米时溶液的吸光度，其数值大小与波长和吸收物质的性质有关，它表示物质分子对特定波长辐射吸收的能力。ε值愈大，分光光度测定的灵敏度愈高；当波长一定时 (一般是在最大吸收波长处)，ε由分子吸收截面a和跃迁几率P决定。ε＝0.87×1020升／（摩尔·厘米）时，a一般为10埃2。P＝1（P值最大为1）时，ε的最大值约为105。像水溶性卟啉一类的大环化合物，与金属离子形成的络合物分子截面几乎达到100埃2，此时ε可能的极限值为8.7×105。水溶性卟啉和铜、铅等金属形成的有色络合物的 ε值一般在5×105左右。
透光率T与A、I0、I有以下关系:T＝I0/I，-lgT＝A。
朗伯－比尔定律是分光光度法和比色法的基础，适用于能量不同的各种电磁辐射，也适用于稀溶液、气体和均质固体。但是，它只是在入射辐射为单色辐射时才能成立，否则会发生偏离。
仪器部件 紫外－可见分光光度计（见彩图）由五部分组成。
辐射源 必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱。钨灯是可见－近红外区常用的光源，适用波长范围为350～2500纳米。较新的仪器采用卤钨灯代替钨灯，它具有较高的发光效率和较长的使用寿命。紫外区（180～460纳米）则用氘灯或氢灯。光声分光光度计采用可调谐染料激光光源，它具有强度大和单色性好的优点。
单色器 它是产生高纯度单色光束的一种装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。单色器由入射、出射狭缝，透镜系统和色散元件组成，色散元件为棱镜或衍射光栅。狭缝愈窄，获得的单色光愈纯，但进入单色器的光源强度愈弱，检测愈困难。
试样容器 又称吸收池。作液体的吸光度测量的样品容器有石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程为 0.5～10厘米，还有体积小、光程长的微型池。
检测器 又称光电转换器。常用光电管或光电倍增管，后者比前者有更高的灵敏度，特别适合于弱辐射的检测。最新的分光光度计有用光导摄像管或光电二级管矩阵作检测器的，此类仪器具有快速扫描的特点。
显示装置 早期的单光束分光光度计采用电流表指示，双光束仪器用记录器扫描；20世纪70年代，改用数字显示、打字机和记录仪。80年代以来，有些高精度分光光度计采用阴极射线管荧光屏显示和打字机，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
仪器类型 单波长单光束直读式分光光度计 光路结构最简单（图2），其特点是经过单色器单色化的光束，通过参比溶液和样品溶液后进入光路。这种仪器一般都是手控操作，费时较长。它要求光源和检测器的供电电压有较高的稳定性。这类仪器适用于固定波长的吸光度测量。
单波长双光束自动记录式分光光度计 图3为此类型仪器的光路图。为提高分辨率和降低杂散光，仪器采用棱镜－光栅组成的双单色系统；以一定速度旋转的半圆形反射镜（或斩波器）使单色器射出的单色光束交替通过参比吸收池和样品吸收池，测得的是透过样品溶液和参比溶液的光强度信号之比。这种仪器克服了单光束仪器由于光源不稳而引起的误差，不仅能直接读数，而且可以对待测组分在整个波段范围内做连续扫描，在几分钟内就能获得精细的吸收光谱，特别适合于作化合物的定性分析和反应动力学研究。
双波长双光束分光光度计 图4
为双波长分光光度计的光路图。用光束分裂器将光源发出的光分为两束，进入各自的单色器，获得两束波长可以任意调节的单色光，用斩光器使两束波长不同的单色光交替通过同一吸收池，经过检测器和电子控制系统，测得在两个波长处的吸光度差。双波长分光光度计克服了单波长分光光度计中由于参比溶液和样品溶液组成不一致和两个吸收池不匹配而引起的误差，可进行混浊样品和混合组分分析，以及导数光谱（见有机官能团定量分析）测定。应用 定量分析 广泛应用于金属、合金、钢铁、化工产品、生物材料、食品、临床、环境样品和药物中微量、超微量和常量的无机物和有机物的测定。
有色的金属离子或化合物可以直接进行测定，例如，钕(Ⅲ)水溶液呈紫红色，可在高氯酸介质中于575纳米处测定。在紫外－可见区无吸收或吸收很弱的元素或化合物，可通过适当的化学反应形成二元或多元有色络合物再行测定。例如测定铁，可用盐酸羟胺将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，在pH2～9时加入邻菲罗啉，生成红色络合物，在508 纳米处进行测定。一些有机化合物可在紫外区进行测定，如测定阿司匹林制剂中少量的水杨酸，可在氯仿介质中于308纳米处测定。
一般分光光度法用于高含量组分测定时，误差较大。为了提高准确度，采用差示分光光度法。这种方法用一个比被测试剂浓度稍低的标准溶液作参比，以代替一般分光光度法所用的参比溶液。设作参比的标准溶液浓度为cS，被测试液浓度为cX，而且cX＞cS，则根据朗伯－比尔定律可得：
ΔA＝AX-AS＝εb(cX-cS)＝εbΔc由此看出，用已知浓度的标准溶液作参比，调节透光率为100％后，则所测被测试液与参比溶液的吸光度差值与两溶液的浓度差成正比。
分光光度法也可用于多组分的同时测定。当各组分吸收光谱互相重叠，但能遵守比尔定律时，如有n个组分，则可选择在n个不同的波长处测定吸光度，再求解n个线性方程组来计算各组分的浓度。在吸收光谱相互重叠的双组分体系中，用双波长分光光度法做二组分的同时测定是非常有效的。此法在测定第一组分时把第二组分当作干扰组分；反之，在测定第二组分时把第一组分当作干扰组分。选择vλ1(参比波长)和vλ2(测定波长)时，必须使干扰组分在vλ1和vλ2处有相同的吸光度，待测组分在vλ1和vλ2处有较大的吸光度差。由此测得的在两波长处的吸光度差只与待测组分的浓度成正比，与干扰组分无关。
定性和结构分析 将未知化合物的吸收光谱的形状、吸收峰的峰数和位置，以及相应的摩尔吸光系数，与纯化合物的吸收光谱图进行比较，如二者非常一致，可认为二者具有相同的发色团；再与红外光谱、质谱法、核磁共振谱以及分子量测定、元素分析等结果相配合。即可进一步推断有机化合物的结构。紫外吸收光谱还可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。
反应动力学研究 研究动力学的基本问题即反应物浓度随时间而变化的函数关系。当反应物和产物的吸收光谱有明显差别时，分光光度法可方便地用于测定反应速率和反应级数，探讨反应机理。
研究溶液平衡 分光光度法是测定络合物的组成、稳定常数、酸碱离解常数的一种常用方法。测定络合物组成最常用的方法是：①摩尔比法，在M+nR＝MRn反应中，将金属离子M的浓度保持不变，改变配位体R的浓度，配制一系列不同摩尔比的溶液，在络合物最大吸收波长处测量溶液吸光度A，将吸光度A对摩尔比[R]/[M]作图，用外推法找出曲线的转折点所对应的摩尔比值，就是络合物的络合比 n。②等摩尔连续变化法，配制一系列溶液，使溶液中金属离子摩尔浓度cM与配位体的摩尔浓度cR之和保持不变，改变cM与cR的比值，在络合物最大吸收波长处测量吸光度，以吸光度A对cM/(cM+cR)作图，与曲线最高点对应的cR/cM值即为络合物的络合比n。此法也可用于测定络合物的稳定常数。
展望 提高灵敏度和选择性是分光光度分析发展中的核心问题。目前正从以下三方面解决：①研制高精度、高自动化、多功能的紫外－可见分光光度计。近几年发展的微处理机、微型计算机控制的紫外－可见分光光度计的性能有很大的提高，在主体仪器上配上各种配件，可扩大仪器的使用范围，适应各种工作的需要。②发展新的测量技术和方法，诸如高阶导函数分光光度测量、多波长测量、计算机多组分分析、热透镜和光声分光光度分析、长光路毛细管吸收测量、催化和速差动力学分光光度法，以及分光光度与分离方法的联用技术，如高压液相色谱法与多波长检测联用技术、浮选分光光度法、树脂悬浮分光光度法等。③研究新的高灵敏、高选择性的新显色剂和三元络合物显色体系，如大环化合物、不对称变色酸双偶氮衍生物、混配络合物、离子缔合络合物显色反应体系，以及胶束增溶分光光度法等。
参考书目
E.D.Olsen， Modern Optical Methods of Analysis，McGraw-Hill， New York， 1975.