水解核酸或多核苷酸分子中磷酸二酯键的酶。是一种核酸酶。根据作用方式，可分为外切酶和内切酶。外切型磷酸二酯酶从多核苷酸的一端，一个一个地切下单核苷酸；内切型磷酸二酯酶作用于多核苷酸内部的磷酸二酯键，把它切成各种小片段。常见的外切酶是蛇毒磷酸二酯酶，从多核苷酸的3′-自由羟基端开始作用，产物是5′-核苷酸。而牛脾磷酸二酯酶从5′-羟基端开始作用，水解生成3′-核苷酸。这两种酶在核酸结构分析中是重要的工具酶。